自噬是一种进化上保守的机制，有助于真核细胞维持平衡和更新。它参与调控了多个重要的细胞过程，包括维持细胞干性、促进胚胎发育、形成固有免疫，并影响衰老和长寿。传统的观点认为，自噬是蛋白质水平上的一系列细胞质事件，但近年来的证据表明，细胞核转录和表观遗传调控也对这一过程有深远的影响。

在细胞适应因营养缺乏及其他代谢紊乱引起的代谢变化时，自噬也发挥着关键的作用。一些营养传感器被证明可以调节自噬，从而维持细胞代谢和能量稳态。然而，m6A等表观转录组修饰在饥饿诱导自噬的调节中发挥什么作用，目前还不清楚。

近日，南方医科大学等机构的研究人员在《NatureCommunications》杂志上发表论文，首次揭示了m6A阅读器YTHDF3作为营养反应器调节自噬诱导的作用和机制，为RNA转录后修饰应对营养缺乏应激的范式提供了新见解。

图片来源：NatureCommunications

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员使用了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。利用赛业生物提供的YTHDF3+/?小鼠，他们构建了YTHDF3?/?小鼠胚胎。在整个实验过程中，他们使用了基于LC-MS的蛋白质组分析、RNA免疫共沉淀测序分析（RIP-seq）和MeRIP-seq分析、免疫荧光染色和自噬流分析等。他们还通过LC-MS/MS和m6A斑点印迹测定了m6A修饰水平。

技术路线

01通过蛋白质组学分析发现饥饿状态下的YTHDF3蛋白水平升高

02通过RNA干扰实验证实YTHDF3上调是自噬所必需的

03在分析m6A水平后发现饥饿处理提高了m6A修饰水平，而YTHDF3需要METTL3介导的m6A修饰来促进自噬

04通过RIP-seq和MeRIP-seq等分析发现FOXO3是YTHDF3促进自噬的关键功能靶点

05YTHDF3与FOXO3mRNA终止密码子附近的m6A修饰位点结合，然后招募eIF3a和eIF4B来促进FOXO3翻译

研究结果

1.YTHDF3上调是自噬诱导所必需的

为了鉴定与自噬相关的表观转录组分子，研究人员对营养缺乏状态下的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）开展了蛋白质组学分析。有趣的是，他们发现m6A阅读器YTHDF3的水平显著升高。

为了分析YTHDF3诱导是否与自噬发生有关，他们利用shRNA载体来敲低MEF中的YTHDF3的表达，发现自噬标志物LC3-II水平下降，而自噬受体蛋白p62积累，表明自噬流降低。挽救实验表明，YTHDF3的异位表达能够提高LC3-II水平，并加快p62降解。他们还利用赛业生物提供的YTHDF3+/?小鼠繁育YTHDF3?/?小鼠胚胎并获得了YTHDF3?/?MEF细胞，发现YTHDF3缺失导致MEF细胞中自噬体和自噬性溶酶体数量大幅减少。这些数据表明，YTHDF3上调是营养缺乏期间的自噬诱导所必需的。此外，后续的分析表明，YTHDF3缺失损害了自噬体形成和溶酶体功能。

2.YTHDF3需要m6A修饰来促进自噬

考虑到YTHDF3是m6A阅读器，研究人员接着探索了YTHDF3是否需要m6A修饰来促进自噬。他们发现，m6A修饰在营养缺乏时显著增加，表明mRNA的m6A水平在自噬诱导期间升高。在分析m6A修饰的书写器（负责添加修饰）和擦除器（负责去除修饰）后，他们发现只有书写器METTL3在营养缺乏后显著升高（图1）。

图1YTHDF3需要METTL3介导的m6A修饰来促进自噬[1]

为了探讨METTL3在营养缺乏时的催化活性，他们在对照细胞和饥饿细胞中开展分析。在利用d3-SAM定量METTL3甲基转移酶活性后，他们发现从饥饿细胞中分离得到的METTL3实现了更高比例的d3-m6A修饰，表明饥饿处理增强了METTL3的m6A修饰能力（图1）。

研究人员推测，METTL3介导的m6A修饰可能是YTHDF3促进自噬的关键。他们在过表达YTHDF3的MEF中敲低METTL3，发现饥饿诱导的LC3-II积累和p62降解均显著减弱。之后他们将野生型和催化活性缺失突变型METTL3重新引入METTL3沉默细胞中，发现野生型METTL3可以挽救沉默细胞的自噬缺陷，而突变型则不行。这些数据表明，YTHDF3需要METTL3介导的m6A修饰来促进自噬。

3.FOXO3是YTHDF3促进自噬的重要靶点

接下来，研究人员试图鉴定在营养缺乏时与YTHDF3差异结合的mRNA。通过两次YTHDF3RIP-seq分析，他们发现在饥饿条件下有个结合上调的转录本和个结合下调的转录本。在分析这些结合位点后，发现m6A峰显著富集于蛋白质编码序列（CDS）和3’UTR中的核心基序‘GGAC’上，这与已发表的研究中m6A峰的分布模式一致。因此，他们推测在营养缺乏时与YTHDF3差异结合的mRNA主要是m6A修饰的（图2）。

为了确定营养缺乏时与YTHDF3结合的潜在m6A甲基化靶点，他们将营养缺乏时YTHDF3RIP-seq的上调峰与MeRIP-seq的上调峰相叠加，获得了86个峰，其中7个基因被注释到自噬通路。在这些基因中，FOXO3是文献报道的调节自噬的最重要转录因子之一。为了验证YTHDF3-FOXO3mRNA的相互作用是否依赖于METTL3介导的m6A修饰，他们在MEF中敲低了METTL3，发现FOXO3转录本的CDS和3’UTR区域的m6A修饰水平均下降。相应地，YTHDF3与FOXO3mRNA的结合也减少。之后，他们还利用含有FOXO3不同序列的探针开展EMSA实验，表明一旦从RNA探针中去除m6A修饰，YTHDF3与探针之间的相互作用就显著减弱。这些结果表明，在营养缺乏期间，METTL3介导的m6A高甲基化是YTHDF3-FOXO3mRNA相互作用所必需的。

图2YTHDF3识别饥饿诱导的FOXO3mRNA的m6A高甲基化[1]

之后，通过进一步的分析，研究人员发现YTHDF3的作用可能是调节FOXO3的翻译，而不是FOXO3的翻译后修饰（如磷酸化）。他们发现，YTHDF3以METTL3依赖性的方式调节FOXO3的表达，并改变FOXO3靶向的自噬基因的表达。他们还在YTHDF3缺陷型细胞中异位表达了FOXO3，发现LC3-II的表达得到恢复，p62逐渐降解。这些结果表明，FOXO3是YTHDF3促进自噬的关键功能靶点。

4.YTHDF3促进FOXO3的翻译，但不影响其mRNA的稳定性

研究人员发现，敲低YTHDF3并不影响FOXO3mRNA的水平，表明YTHDF3可能对FOXO3的翻译有影响。YTHDF3已被报道通过与40S和60S核糖体亚基相互作用促进RNA的翻译，于是他们开展了多聚核糖体分析，发现在YTHDF3缺陷型细胞中，FOXO3mRNA在多聚核糖体中的水平低于对照细胞，表明YTHDF3缺失减弱了FOXO3翻译。通过突变分析，他们进一步确认了FOXO3-CDS终止密码子附近的m6A位点在YTHDF3促进FOXO3翻译时发挥关键作用。同样地，FOXO3-3’UTR区域终止密码子附近的m6A位点也参与了FOXO3翻译调节。

翻译控制通常发生在起始阶段。在开展co-IPLC-MS/MS分析后，研究人员注意到多个翻译起始因子与YTHDF3存在相互作用。其中，eIF3a和eIF4B是营养缺乏时最明显富集的。通过不同核糖体组分的Westernblot分析和分子对接模型分析，他们认为eIF3a、eIF4B和YTHDF3之间很可能存在蛋白质相互作用。在敲低eIF3a或eIF4B后，FOXO3蛋白水平降低，表明YTHDF3可能与eIF3a和eIF4B相互作用来促进FOXO3翻译。

研究结论

图3YTHDF3诱导自噬的可能机制[1]

总的来说，这项研究揭示了表观转录组学与自噬之间的重要关联。一系列的证据表明，m6A阅读器YTHDF3作为营养反应器，与FOXO3mRNA终止密码子附近的m6A修饰位点结合，然后招募eIF来迅速促进FOXO3翻译，并进一步从转录上激活一系列核心自噬基因，从而促进自噬（图3）。

原文检索：

[1]Hao,W.,Dian,M.,Zhou,Y.etal.Autophagyinductionpromotedbym6AreaderYTHDF3throughtranslationupregulationofFOXO3mRNA.NatCommun13,().

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